| I. Principe de fonctionnement | ||
|
Leurs fonctionnements peuvent être très simplifiés mais nécessitent néanmoins une série d'étapes incontournables : la construction de puces, la préparation des sondes, l'hybridation avec les cibles et la lecture de l'empreinte d'hybridation suivie du traitement du signal. La réaction cardinale qui s'opère dans les puces à ADN est celle là même qui, découverte par Watson et Crick a fondé la biologie moléculaire, à savoir, l'hybridation entre séquences nucléotidiques complémentaires. Une fois synthétisés, des oligonucléotides (simple brin) greffés sur la puce constituent les sondes dont le rôle est de détecter des cibles complémentaires, marquées par fluorescence et présentes dans le mélange complexe à analyser. Les sondes sont, soit déposées par une tête d'impression commandée par un robot, soit synthétisées in situ. L'élément principal de la puce à ADN est l'unité d'hybridation appelée Plot lequel, présent en un grand nombre d'exemplaire, possède une adresse connue et correspond, par exemple, à un gène indexé dans un catalogue. Après hybridation et lavage, le signal moyen de chaque plot est enregistré grâce à un microscope confocal. Enfin le traitement numérique du signal permet d'établir la concentration exacte des cibles duplexées et forme l'empreinte d'hybridation. Les dimensions du plot représente actuellement l'une des limites des puces à ADN qui se répercute sur leur densité (Nombre de plot/unité de surface), ainsi que leur complexité (nombre de gènes ciblés) (3) . Par exemple, les procédés mis au point à ce jour permettent d'obtenir des densités de plot de l'ordre de 10^15 à 10^16 plots/cm² et dont l'équivalent en ARNm peut correspondre à l'ensemble des ARNm d'un type cellulaire donné (10 000 à 50 000). La taille des sondes représente une seconde limite à ce procédé (aujourd'hui 10-20 nt/sondes). En effet, l'utilisation de sondes de tailles supérieures conduit à la formation de boucles (autohybridation) qui empêche l'hybridation avec les cibles (7) . |
| II. La Phase de fabrication et de fixation des sondes (1,4) | ||
|
Le fonctionnement des puces à ADN est basé sur le phénomène d'hybridation, à savoir, l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences de nucléotides. Cette hybridation forme un duplex (double brin).Le brin dont on connait la séquence, intégrale ou partielle, constitue la sonde et celui que l'on souhaite caractériser est la cible. L'utilisation de l'hybridation, n'est pas nouvelle. En effet la PCR, les différents blots (Northern, Southern et Dot) notamment, utilisent ce principe. L'originalité des puces est la constitution de l'hybridation sur phase solide, permettent de travailler simultanément avec un nombre de sondes considérables, dont les positions sont parfaitement connues. Les puces actuelles diffèrent par les techniques de fabrication et de fixation des sondes qui peuvent être classé selon deux écoles:
En 1989, les chercheurs de l'institut de Biologie Moléculaire de Moscou ont évoqué l'idée de fixer des oligonucléotides sur des plots de gel de polyacrylamide activés. Les oligonucléotides nécessaires sont prélevés et placés sur les plots par l'intermédiaire d'une micropipette robotisée.
Développée en France par Cis Bio International en partenariat avec le CEA de Grenoble, cette méthode d'adressage consiste à activer spécifiquement une microéléctrode de 50 micro-mètre en or et cela afin d'adresser une séquence définie d'oligonucléotides. On réalise sur chaque électrode une éléctro-polymérisation entre un pyrolle normal et un pyrolle sur lequel a été fixé un oligonucléotide de façon covalente.
Ce principe développé par les Hollandais d'Affymetrix utilise la synthèse in situ. Des groupements photolabiles protègent les groupements réactifs qui interviennent dans la liaison avec le nucléotide. A l'aide de masques on découvre spécifiquement certains plots et on y fixe un nucléotide donné qui possède lui aussi un groupement photolabile chargé de protéger la liaison avec le nucléotide suivant. Les oligonucléotides sont synthétisés de façon combinatoire avec l'utilisation successive de différents masques photolitographiques de formes définies. Cette technique est connue sous le nom de VLSIPS (Very Large Scale Imobilised Polymer Synthesis)et est aujourd'hui la plus avancée. Cette technique permet de synthétiser rapidement un grand nombre de nucléotides différents. Par exemple, pour une sonde longue de huit nucléotides, il existe 4^8 séquences différentes, soit 65 536 combinaisons. Dans le cadre de la synthèse en Bandes orthogonales, l'application successives de 32 masques permet de toutes les synthétiser. D'autres techniques permettent d'abaisser le nombre de masques nécessaires
Une autre innovation intéressante conçue par Nanogène utilise le pilotage électronique de l'hybridation. Sur cette puce chaque microéléctrode crée un champ électrique qui dans un premier temps favorise l'hybridation et accélère la réaction par une concentration éléctrophorétique des cibles autour de la sonde et dans un second temps via une inversion de courant, répulse les sondes non ou mal hybridées limitant ainsi le risque de mesappariements. Pour les autres puces, les méthodes de stringence classiques (Salinité, température, Ph) sont utilisées. |
| III. La lecture de l'hybridation(1,4,5) | ||
|
La phase de lecture de la puce suit la phase d'hybridation. Il s'agit ici de repérer ce qui a été effectivement hybridé, c'est à dire de repérer à quelle adresse les sondes sont complémentaires des cibles de l'échantillon test. Lors de la phase de lecture, un laser excite les molécules fluorescentes liées aux cibles hybridées et un microscope confocal lié à un ordinateur capte et analyse la lumière émise par l'excitation de ces molécules. Cela aboutit à une empreinte d'hybridation. On peut se réjouir en remarquant les progrès effectués au niveau de la détection de l'hybridation. En effet, l'ancienne méthode de détection, dite classique risque d'être remplacée par un procédé qui rendant au terme de puce son aspect électronique, permet, grâce à des phénomènes physiques dont la quantification est possible, l'analyse de courants locaux résultants de l'hybridation, lesquels sont détectés par des semi-conducteurs qui constituent le support de fixation des sondes. |
