On utilise dans ce cas une sonde de référence correspondant à la séquence sauvage avec en parallèle, plusieurs sondes identiques à une mutation prés. Ces sondes vont couvrir l'ensemble des mutations potentielles (substitution, délétion, addition). De manière générale, l'analyse de substitutions implique donc l'utilisation de quatre sondes, une pour la séquence sauvage et trois pour chacun des nucléotides pouvant se substituer au nucléotide original.

Cette tâche s'effectue par des comparaisons de détection de sondes hybridées avec des séquences de l'échantillon testé par rapport à celle résultante de l'échantillon sauvage, le tout combiné avec une méthode faisant appel au double marquage fluorescent.

Un tel procédé a été appliqué afin de détecter des mutations hétérozygotes dans l'exon 11 du gène BRCA1 (7) . Cette détection mettant en place des ensemble redondants et chevauchants de 14 sondes de nucléotides correspondant chacune à des types de mutations différentes et à deux sondes sauvages

• Trois sondes pour les substitutions potentielles en position centrale.
• Trois sondes pour les insertions de 1 nucléotide en position centrale
• Cinq sondes pour des délétions en position centrale.

Enfin, pour s'affranchir des différences de conditions d'hybridation, le nucléotide étudié aura une position centrale sur la sonde.

Une fois la sonde constituée, un double marquage fluorescent qui en vert (fluorescéine) correspond au type sauvage et en rouge (Coerythrine et streptavidine) associé aux ARN test. C'est après une analyse de l'empreinte d'hybridation que l'on peut apprécier les quantités ARN de référence ou testé. C'est par un tel procédé qu'ont pu être mis en évidence après l'étude de 15 échantillons test 14 mutations connues ainsi que 8 nouveaux polymorphismes. Les puces à ADN furent aussi utilisées dans le cadre des recherches concernant les mutations de la protéase du VIH (Cible de nombreux antiviraux). C'est grâce aux puces utilisées au cours de cette expérience que l'on a pu mettre en évidence que l'acquisition de la résistance du VIH vis à vis des médicaments résultait d'un polymorphisme naturel et non d'un phénomène adaptatif Une puce spécifiquement dédiée à l'étude des mutations de ce gène est d'ailleurs commercialisée par Affimetrix sous le nom de Gene Chip Tm HIV PRT .

Fig. 6- Principe de la puce Gene Chip HIV P

Le même principe de puce est actuellement utilisé pour le séquençage des mutations éventuelles du Virus de l'Hépatite C (9) .

Ne pouvant s'appliquer que sur des brins déjà séquences, l'analyse de mutations se voit aussi toutes dédier à l'ADN mitochondriale qui, n'est présent chez un individu en une unique version moléculaire (L'ADN mitochondrial est d'origine maternelle).

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En effet une autre application majeure des puces à ADN est l'étude de ce que l'on peut appeler le " transcriptome ". Dans un cas général, les sondes sont formées d'ARN complémentaires, utilisées de façon redondante , c'est à dire que la représentation d'un gène se fait par environ 300 paires de sondes de 20 nucléotides. La paire étant utile pour le contrôle d'hybridation. Une des deux sondes est sauvage, tandis que l'autre est mutée en position centrale.

Deux principes de mesure de l'expression des gènes peuvent être distingués

Le premier faisant appel à la comparaison à des cibles standards ajoutées dans l'extrait Le second étant le résultat de l'analyse successive par la même puce d'un échantillon test et d'un échantillon de référence les deux étant marques par des fluorochromes différents De nouveaux procédés mis au point par Affimetrix permettent de détecter une concentration minimale de 1 :300000 et devrais d'ici peu atteindre une complexité de plusieurs dizaine de milliers de gènes.

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Les limitations de la technique de séquençage de Sanger amenèrent les chercheurs à trouver une méthode de séquençage, pour séquencer plus et plus vite. Les puces semblaient toute dédiée à cette utilisation.

En effet, lorsque l'on a très peu d'informations sur une séquence, la synthèse des sondes en masse est nécessaire. Et les puces facilitent grandement cette tâche.

Dans le séquençage par hybridation, une séquence nucléotidique linéaire est considérée comme un ensemble de sous-séquences chevauchantes dont la détermination simultanée et le réassemblage au moyen d'un programme informatique spécifique permet, la reconstitution de la séquence étudiée.

Etant donnée l'invariabilité des sondes fixées aux puces dans le cadre du séquençage, une industrialisation de ces dernières serait possible et faciliterait grandement la tâche des laboratoires. Cependant, il existe plusieurs obstacles à cette ouverture. Les répétitions, nombreuses dans le génome humain constituent un obstacle au séquençage par hybridation, en empêchant le calcul d'une solution unique dans la réorganisation des séquences chevauchantes.

L'équipe du biologiste Russe A.D. Mirzabekov, cherchant à contrecarrer le problème des répétitions de séquence, a opté pour la mise au point de puces de capacité supérieure qui une fois couplée au principe de double hybridation, affranchit la séquence de doutes éventuels sur son intégrité (3) .

Un autre concept d'analyse développé par A.B. Chetverin et F.R. Kramer semble surmonter pour de bon cet obstacle. En effet, en plus du principe de séquençage par hybridation, on associe le principe classique de séparation selon la taille, dont la judicieuse combinaison permet, malgré l'analyse de séquences d'ADN complexes d'éviter l'étape de clonage.

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L'utilisation de signature génétique connue pour identifier des délétions et observer le phénotype des souches sous diverses pressions de sélection est un exemple montrant la grande simplification des protocoles rendue possible par l'utilisation des puces à ADN.

Le Principe

Les souches mutantes sont construites par recombinaison homologue entre un fragment d'ADN contenant un marqueur de sélection dominant (Kan R), la séquence signature unique de 20 pb ainsi qu'un site commun permettant une PCR ultérieure, et un cadre ouvert de lecture, correspondant au gène à déléter.

Le panel des souches mutantes est mis en culture parallèle sur différents milieux de culture. Chaque milieu de culture est analysé à différents temps.

L'exemple de Shoemaker porte sur 11 souches mutantes par délétion, auxotrophe pour l'adénine ou le tryptophane. Le panel des 11 souches délétées est mis en culture parallèle sur 3 milieux différents

· Milieu complet - SDC

· Milieu complet sans adénine: SDC-Ade

· Milieu complet sans tryptophane: SDC-Trp

Les résultats observés sont probants, la baisse d'hybridation sur certains plots reflètent directement la pression de sélection, reflétant ainsi directement un phénotype quantitatif :

Les avantages

Ce procédé présente quatre avantages

· Grâce à la grande sensibilité offerte par la détection de fluorescence sur les puces à haute densité, un grand panel de souches signées mutantes par délétion peut être étudié simultanément. (Nombre de souches potentielles > 6000).

· Les souches délétées le sont totalement. On n'observe donc pas d'activité résiduelle ou altérée causée par un produit tronqué.

· Les souches délétées avec des phénotypes intéressant sont identifiables directement grâce à la signature nucléotidique unique (tag), sans clonage ni séquençage supplémentaire.

· La nature quantitative des résultats d'hybridation permet de révéler de subtils phénotypes qui aurait été occulté par une analyse subjective (de type: " Cela pousse "," Cela ne pousse pas " ou "cela pousse moyen "). Ici les résultats sont quantitatifs.

Sans cette technique de signature et d'hybridation sur puce, les mutants par délétions sont analysables uniquement de manière individuelle. La signature permet l'étude d'un grand panel de mutants et l'exemple de Shoemaker est transposable à de grand nombre de gènes dont on veut déterminer le rôle biologique.

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Le controle de la qualité de l'eau passe aujourd'hui par l'analyse de 64 paramètres de qualité dont certains doivent être surveillés en permanence. L'association de Bio-Merieux et de la Lyonnaise des Eaux dans le projet Aquagen a pour objectif une amélioration technique et une réduction des coûts de l'analyse de l'eau. Les puces à ADN premettent de detecter le présence, même en très faible quantité d'un micro-organisme en le reconnaisant à travers son empreinte génétique. L'utilisation de puces à ADN permet un diagnostic et donc une intervention plus rapide et moins couteuse.

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Les puces à ADN permettront bientôt de controler les résistances du virus du sida à différentes molécules et ainsi d'adapter au plus juste les traitements. Certains d'entre eux ayant en effet de nombreux effets secondaires il est préferable de connaitre au préalable la pertinence de telle ou telle stratégie de traitement.

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Les possibilités des puces à ADN sont inversement proportionnelles à leurs tailles.

Il se pourrait en effet, que des ARN artificiels soient effectivement capables de remplacer des anticorps monoclonaux et cela sans pour autant atténuer les affinités obtenues avec l'utilisation d'anticorps classiques. Une expérience de ce type à été réalisé dans le cadre d'une étude sur l'hormone TSH (Thyroïde Stimulating Hormone), ou encore à l'aide du mode de microscopie à champ proche qui a été essayé au cours du dosage de l'ACE (Angiotensine 1 Converting Enzyme).

Les puces à ADN devraient permettre l'accès aux immuno-analyses simultanées du même prélèvement pour le diagnostic moléculaire des maladies infectieuses ou encore, dans le cadre de recherche sur les résistances aux antibiotiques.

Les puces à ADN risquent de bouleverser les recherches en Génétique, grâce à la mise au point imminente de puces de polymorphismes dont les applications seront des plus nombreuses:

- L'étude de la diversité génétique dans le cadre de la génétique des populations

- L'établissement de cartes génétiques affinées

- La recherche accélérée sur les maladies à origine génétique (Dépistage,Facteurs de risque...)

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Les différents aspects évoqués et présentés précédemment sont révélateurs des immenses potentialités des puces à ADN, ainsi que de l'avenir qui leur est promis. C'est pourquoi une fois l'ensemble des étapes clés de la fabrication telle que l'adressage ou l'analyse sera maîtrisé, l'unique frein à leurs perfectionnements sera le temps d'extraction ou encore le temps d'hybridation entre les deux brins, ce qui pour certains types de puces est déjà maîtrisé.

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